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你們瞭解雙抗夾心ELISA法嗎╃◕?
時間•·:2022-10-10 點選次數•·:178

雙抗夾心ELISA法是指講特異性針對代測抗原的抗體包被於96孔微孔板中☁▩☁,製成固體載體☁▩☁,向微孔中分別加入標準品或標本☁▩☁,其中代測抗原連線於固相載體的抗體結合☁▩☁,然後加入生物素化的針對代測抗原的抗體☁▩☁,形成夾心☁▩☁,將未結合的生物素化抗體洗淨後☁▩☁,加入HRP標記的親和素☁▩☁,再次*洗滌後加入TMB底物顯色▩☁│。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色☁▩☁,並在酸的作用下☁▩☁,轉化成最終的黃色▩☁│。顏色的深淺和樣品中的待測抗體原正相關▩☁│。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(O.D.值)☁▩☁,用於樣本中待測抗原濃度測算▩☁│。

 

1.材料與儀器

1) 包被緩衝液 (pH 9.6 0.05 M 碳酸鹽緩衝液)

2)洗滌緩衝液 (pH 7.4☁▩☁,0.15 M PBS

3)稀釋液

4)終止液(2 M H2SO4

5)底物緩衝液 (pH 5.0

6)四甲基聯苯胺(TMB)使用液

72☁▩☁,2’-連氮基--3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺(ABTS)使用液

8)抗原◕✘、抗體和酶標記抗體•·:按說明書處理▩☁│。

9)標準品•·:用稀釋液稀釋成梯度濃度溶液▩☁│。

1096 孔聚苯乙烯塑膠板 (酶標板)▩☁│。

 

2.步驟

將特異性抗體與固相載體連線☁▩☁,形成固相抗體•·:洗滌除去未結合的抗體及雜質▩☁│。

 

加受檢標本•·:使之與固相抗體接觸反應一段時間☁▩☁,讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合☁▩☁,形成固相抗原複合物▩☁│。洗滌除去其他未結合的物質▩☁│。

 

加酶標抗體•·:使固相免疫複合物上的抗原與酶標抗體結合▩☁│。*洗滌未結合的酶標抗體▩☁│。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關▩☁│。

 

加底物•·:夾心式複合物中的酶催化底物成為有色產物▩☁│。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量▩☁│。

 

根據同樣原理☁▩☁,將大分子抗原分別製備固相抗原和酶標抗原結合物☁▩☁,即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體▩☁│。

雙.jpg


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